罗非鱼gsdf在性腺的表达及其在性别决定中的功能

【摘要】TGF-p超家族成员在脊椎动物的生殖、发育、和生长等方面均具有重要作用。gsdf(gonadalsomaderivedfactor)是TGF-p超家族新成员,以往的研究表明gsdf仅存在于硬骨鱼类和腔棘鱼类,且主要表达于性腺。Gsdf功能研究以往多是通过分析其在性腺的表达模式来推测它对于性别决定与分化的作用,鲜有研究通过缺失功能(lossoffunction)和获得功能(gainoffunction)两方面研究Gsdf对性别决定与分化的影响。尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)是重要的世界性养殖鱼类,具有XX/XY性别决定类型。因易于获得单性鱼苗以及全基因组测序的公开,罗非鱼已成为研究鱼类性别决定与分化的良好实验模型。本研究从基因组水平和性腺转录组水平对罗非鱼gsdf进行分离鉴定,并做进一步的生物信息学分析；通过RT-PCR、real-timePCR和免疫组化等方法分析gsdf/Gsdf在罗非鱼中的表达模式；使用转基因过表达和CR1SPR/Cas9介导的基因敲除两种方法,从正反两方面对Gsdf进行功能研究,以揭示Gsdf在罗非鱼性别决定与分化中的作用和分子机制。主要研究结果如下：1)本研究成功从罗非鱼中分离出gsdf基因。氨基酸同源性比对发现：dsdf基因在鱼类进化过程中较保守,其中罗非鱼的gsdf序列与斑马宫丽鱼(Maylandiazebra)的相似度最高,达90%。共线性分析结果显示：鱼类gsdf基因在其上下游具有十分保守的基因座位,而在四足类对应染色体的相同部位却没有发现gsdf基因。此外,我们在软骨鱼象鲨(Callorhinchusmilii)中也分离出gsdf基因,此结果表明gsdf不仅存在于硬骨鱼类和腔棘鱼类,在软骨鱼类中也存在,而在四足类中可能是次生性丢失了。2)通过RT-PCR研究gsdf在罗非鱼成鱼不同组织的表达模式,结果表明：gsdf高表达于精巢,在卵巢中的表达要远远低于精巢。此外,gsdf在垂体中也有少量表达。Real-timePCR分析雌雄个体发育过程中gsdf在性腺的表达模式发现：gsdf在5dah(daysafterhatching)的XY性腺中已经开始表达,随后其表达升高,到30dah达到最高值,之后其表达逐渐下调；在XX性腺中也是在5dah时已经开始表达,其表达趋势与在XY性腺中相似。在整个发育过程中gsdf在XY性腺的表达都远高于XX性腺。同时我们还制备了罗非鱼Gsdf多克隆抗体,利用该抗体对其进行免疫组化检测其蛋白表达模式发现：与real-timePCR检测结果一致,Gsdf从5dah开始直到成鱼都高表达于XY性腺精原细胞周围的体细胞中。由于生殖细胞的分化方向主要依赖性腺体细胞的类型(McLaren,2000),因此初步认为Gsdf可能在罗非鱼雄性性别决定中发挥重要的作用。此外,Gsdf在XX性腺中也一直有表达,但表达量较低,主要表达于卵原细胞周围的体细胞中。3)利用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术在罗非鱼XY个体成功敲除Gsdf,最高突变率达到90%,亚克隆测序证实靶位点产生删除或插入多种不同数目碱基的突变类型。此外,CRISPR/Cas9诱导的高突变率个体在当代(GO)就能产生明显的表型。常规组织学检测结果显示：3月龄XY个体Gsdf缺失导致部分阳性鱼精巢血管附近出现卵母细胞,产生不完全的性逆转。免疫组化检测结果表明：在3月龄敲除阳性个体中检测到雌激素合成关键酶芳香化酶Cyp19a1a的表达,该酶通常在XX性腺特异表达。同时还检测到雄激素合成关键酶Cyp11b2的表达量与对照组相比明显降低。采用酶联免疫吸附法检测XY个体Gsdf缺失后血清雌激素和雄激素水平,结果显示：与正常XY对照血清相比,敲除鱼雌激素(E2)水平上升,而雄激素(11-KT)水平下降。6月龄XY个体Gsdf缺失则导致其完全性逆转为卵巢,与XX对照组卵巢几乎没有差异。此外,构建转基因过表达载体pIRES-hrGFP-1a-gsdf,在罗非鱼XX个体中过表达Gsdf.孵化后90天提取30尾转基因注射鱼基因组DNA,并用载体特异性引物筛选出8尾阳性转基因鱼,阳性率为27%。常规组织学观察Gsdf过表达阳性个体性腺,发现其中有6尾发生了性逆转,呈现为精巢组织。免疫组化检测发现性逆转性腺中有雄性精巢特异的Dmrt1和Cyp11b2表达,但是没有Cypl9a1a的表达,表明此时的性腺已经完全性逆转为精巢。以上结果表明Gsdf可能对精巢的发育和维持具有重要作用。综上所述,本研究从罗非鱼中分离出gsdf,它在进化过程中较保守；gsdf可能起源于原始的有颌类,现存于包括软骨鱼类(象鲨)、弓鳍鱼类(雀鳝)、总鳍鱼类(矛尾鱼)、辐鳍鱼类(斑马鱼)等鱼类的各个类群,但不存在于四足类中；Gsdf在性别决定关键时期5dah就在性腺表达,且在精巢高表达,在同时期的卵巢中其表达量要远低于精巢,推测其可能参与雄性性别决定过程；在XY个体中敲除Gsdf发生由雄向雌的性逆转而在XX个体中过表达Gsdf则发生由雌向雄的性逆转,此结果表明Gsdf可能对精巢的发育和维持具有重要作用。
【作者】杨惠惠；
【导师】王德寿；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】罗非鱼；gsdf/Gsdf；表达；基因敲除；转基因过表达；性别决定；

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